《超级马里奥 64 DS》游戏是以N64的经典3D动作游戏为基础所制作，不同于N64版中玩家仅能操作马里奥，《超级马里奥 64 DS》游戏中将有马里奥、路易基、瓦里奥与耀西这四个角色可供玩家选择。除了角色增多之外，游戏的内容也大幅的增加，新增了许多关卡，能源之星的数目也增加到150颗。游戏利用NDS（IDS）的无线网络功能来提供各种多人游玩模式，而且多人模式只需要一个游戏卡匣就可以提供多人一同游玩。